浙江甲基化研究

今天体育问答就给我们广大朋友来聊聊江西甲基化研究,以下观点希望能帮助到您找到想要的答案。

本文目录导航：

• 1、甲基化是什么意思
• 2、什么是甲基化
• 3、甲基化知识点
• 4、易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程

甲基化是什么意思

优质回答甲基化是指从活性甲基化合物（如S-腺苷基甲硫氨酸）上将甲基催化转移到其他化合物的过程。

甲基化是可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸（RNA）加工。

蛋白质甲基化。蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次（称为一甲基精氨酸）或两次（精氨酸甲基转移酶（PRMTs）将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同一个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸，或者在每个氮端各加一个甲基成为对称性二甲基精氨酸）赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一次、两次或三次。

在组蛋白中，蛋白质甲基化是被研究最多的一类。在组蛋白转移酶的催化下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因表达，从而形成为表观遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形式。

甲基化的类型介绍：

1、DNA甲基化

脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80％—90％的CpG位点已被甲基化。

但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56％的哺乳动物基因中的启动子有关。1％—2％的人类基因组是CpG群，并且CpG甲基化与转录活性成反比。

2、蛋白质甲基化

蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次（称为一甲基精氨酸）或两次（精氨酸甲基转移酶（PRMTs）将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同一个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸，或者在每个氮端各加一个甲基成为对称性二甲基精氨酸）赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一次、两次或三次。

在组蛋白中，蛋白质甲基化是被研究最多的一类。在组蛋白转移酶的催化下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因表达，从而形成为表观遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形式。

内容参考：百度百科-甲基化

什么是甲基化

优质回答金属汞和二价离子汞等无机汞在生物特别是微生物的作用下会转化成甲基汞和二甲基汞,这种转化称为生物甲基化作用.这种转化的逆过程称为生物反甲基化作用.这两种作用构成了微生物的汞循环.

机理 20世纪60年代末明确提出在汞的生物甲基化中起主要作用的是微生物.因微生物类群的不同,甲基化作用可在需氧或厌氧条件下进行,其转化机理主要有酶促反应和非酶促反应两种.非酶促反应机理依据厌氧菌甲烷形成菌 (Methanoenic omelia) 合成的甲基钴氨素作为甲基供体,在有三磷酸腺苷(ATP)和中等还原剂的条件下把无机汞转化成甲基汞或二甲基汞,与此同时甲基钴氨素转化成羟基钴氨素.甲基化的酶促反应是由微生物直接参与进行的.细菌利用培养基中丰富的维生素,在细胞内产生转甲基酶,促使甲基转移,但酶的种类还不清楚.从底泥、土壤和鱼的内脏、鱼鳃中发现,能使汞甲基化的微生物种类很多,厌氧菌中有匙形梭状芽孢杆菌(Clostridium cochlearium),需氧菌中有荧光极毛杆菌(Pseudomonas fluorescens) 草分枝杆菌 (Myco-bacterium phlei)大肠杆菌等甲基化取决于酶的活性,并与营养环境以及半胱氨酸和维生素B(等因素有关.厌氧条件下硫化物的存在往往会抑制汞甲基化的进行.在自然界中甲基化的加快会引起水体水质恶化,使毒性加大.

自然界的生物是相互作用和相互制约的.受汞污染的底泥中还存在着另一类抗汞微生物,它们有反甲基化作用,能去除甲基汞的毒性.1968年以来已发现各种抗汞细菌200多株,典型菌株为假单胞杆菌K62(Pseudomo-nas K62).这些微生物能把氯化汞还原成金属汞,也可使有机汞如甲基尔、乙酸汞和苯基汞等转化成金属汞以及相应的化合物,如甲烷、乙烷和苯.利用微生物的这种功能可发展生物冶汞技术.

微生物对汞的抗性机理同对药物的抗性机理相似.1971年有的学者从抗药物的大肠杆菌中提取到一类汞释放酶系,其中主要的酶为S-1酶,它起着使C-Hg 链裂解的作用,而后再经金属汞释放酶（MMR-酶）使汞化合物还原成金属汞.在这种反应中,黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶,葡萄糖脱氢酶起传递电子的作用.

应用 随着分子遗传学的发展,生物甲基化和微生物抗汞的生态学研究已推向分子水平,近年来开展了微生物转化汞的遗传控制研究.1979年的研究指出,细菌的抗汞性能受遗传质粒和染色体的调节和控制,某些具有抗汞性的细菌质粒有移位的潜力,使不具有抗性的细菌细胞获得抗性.这将进一步阐明底泥中细菌能使汞迁移转化和使废料中汞实行再循环的基础.为了提高微生物的抗汞能力,有的学者已应用质体转移新技术得到新的质粒（MER质粒）,细菌具有这种新质粒,抗汞能力可提高40倍左右.

利用微生物还原汞的功能,可使金属汞沉淀回收,挥发的汞可用活性炭吸附.微生物除汞方法主要有：①选育高效抗汞微生物处理含汞废水：如应用选育的高效抗汞菌——假单胞杆菌 K62可处理含甲基汞、乙基汞、硝酸汞、乙酸汞、硫酸汞、氧化汞和氯化汞等废水,金属汞回收率达80％,菌体能重复用三次.②采用除汞：依靠活性污泥中的抗汞菌将汞还原为金属汞,活性污泥系统本身还可吸附汞.③采用滤池法除汞：用驯化活性污泥挂膜处理生化需氧量 (BOD)低的含汞废水.④使用硫化氢沉淀汞：借助于其他微生物产生的硫化氢与水溶性汞结合成硫化汞,硫化汞溶度积很小,可以在沉淀后除去.

近十几年来,汞的生物转化的研究受到学者们的重视.中国在这方面的研究还刚刚开始.关于汞的生物甲基化和微生物抗汞机理虽比其他金属转化机理清楚,但有不同的见解和学说.微生物法除汞的研究,目前仅限于配水和小型试验.关于汞转化的遗传学控制研究在理论和实践上都具有重要意义.

甲基化知识点

优质回答所以首先需要搞清楚什么是表观修饰，表观遗传学，以及为什么关注DNA甲基化这其中一种表观修饰！

表观遗传修饰是指对基因组功能的相关修饰，通过一系列生物学修饰改变基因的活性而不是DNA的核苷酸序列影响基因的表达。对基因组功能的相关修饰主要包括对**DNA、RNA、以及组蛋白等的修饰，这些修饰改变了染色质的局部电化学特性和构象，从而调节基因的转录活性。

其中对 组蛋白修饰 主要是究方法通常是chip-seq技术，我们已经在生信技能树发布了系统性的chip-seq教程，这里就不再赘述。组蛋白是染色质的重要组成部分，主要分为H2A、H2B、H3、H4，与DNA缠绕可形成核小体。 组蛋白修饰 是在组蛋白N末端的氨基酸残基上发生的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、羰基化、糖基化等。

DNA甲基化 是表观遗传学领域一个重要的研究方向，真核生物中最常见的DNA修饰非 5-甲基胞嘧啶（5mC） 莫属了，然而在原核生物中最常见的DNA修饰方式则为 N6-methyladenine (6mA) ，即腺嘌呤第6位氮原子甲基化修饰。

人类是真核生物 ，所以当然是5mC的DNA甲基化形式的检测咯。人的参考基因组约30亿碱基，上面不到1%是 CpG位点，可以被甲基化，也就是说不到3千万个 CpG 位点。这些 CpG 位点中，大约 60~80% 被甲基化。主要是而启动子等特殊区域存在 未被甲基化的CpG 岛，那些区域的CpG 位点比较富集。目前研究表明，肿瘤细胞的甲基化水平平均是低于正常细胞的。

亚硫酸盐是甲基化探测的“金标准”，不管是芯片或者甲基化测序，都要先对DNA样品进行亚硫酸盐处理，使非甲基化的C变成U，而甲基化的C保持不变，从而在后续的测序或者杂交后区分出来。

关于DNA甲基化检测手段介绍，我觉得 Make Decision: DNA甲基化检测方法，哪一款适合你？ 写的就足够好了。同样的，早期研究以芯片为主，从成本的角度来看，也是芯片为主，但是测序数据更丰富。

可选的甲基化芯片产品就少很多，绝大部分是illumina公司产品的，从27K到450K到850K甲基化芯片。比较好的介绍是：Illumina 琪先生 2018-07-17的 一文了解 MethylationEPIC 850K 甲基化芯片

Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片包含了原先的Infinium Methylation450 BeadChip芯片90%的内容，这种选择可提供一种广泛、全面的甲基化组图谱。而且还靶定了ENCODE计划中确定为潜在增强子的区域，还有FANTOM5计划在各种组织类型中确定出的增强子。详细如下：

Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片的数据分析是由GenomeStudio Methylation Module模块所支持，让研究人员能够对小规模研究开展差异甲基化分析。GenomeStudio软件2011.1版特有高级可视化工具，让研究人员能够在单幅图中查看大量的数据，如热图、散点图和线图

甲基化检测方法多达上百种，哪怕是基于NGS的测序技术，也有BS-Seq、MeDIP-Seq、RRBS-Seq、WGBS、MBD-Seq、SMRT 等，我发现 何聪聪 诺禾科服 2016-09-10 介绍的比较齐全，摘抄送给大家，原文在： DNA甲基化研究方法速递

我们我们介绍甲基化测序数据的一般分析流程的时候，主要是针对WGBS技术的数据。

BS-Seq（亚硫酸氢盐测序）有两个缺点：

针对这两个缺陷，科研界一直在尝试研发改进方法。

复旦大学于文强教授团队开发出了一种新的全基因组检测的方法 GPS。该方法利用 T4DNA 聚合酶的 3′-5′外切酶活性和 5′-3′聚合酶活性，使得双端测序的一端是基因组原序列，另一端是转化后的表观序列。该方法极大提高了比对效率和准确性。

当然了，也是可以用低通量手段，专注 特异性位点甲基化检测 ，有：

比如发表在BMC Med. 2009 Oct 的文章Genomic and epigenetic evidence for oxytocin receptor deficiency in autism.里面Gregory等研究者通过 亚硫酸氢盐测序 的方法对119例ASD患者和119名健康人进行了DNA甲基化分析，分析了与调节OXTR表达相关的CPG在外周血和颞叶皮质的甲基化水平，发现ASD患者的CPG甲基化水平在外周血和颞叶皮质均较健康人明显升高。这个研究里面的bisulfite sequencing (BSS)就是低通量，仅仅是关注感兴趣的基因而已：

生物学意义，通常是建议大家看教科书吧，DNA甲基化是最早被发现的表观遗传修饰途径之一，参与许多重要的细胞过程，如基因组印记、X染色体灭活、转录抑制、胚胎发育等，与精神分裂症、Rett综合征、肿瘤等多种疾病的发生和发展密切相关。

尤其是我感兴趣的肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体甲基化水平的降低与局部甲基化水平的升高。在肿瘤细胞中，癌基因处于低甲基化状态而被激活，抑癌基因处于高甲基化状态而被抑制。

比如： DNA甲基化与肿瘤风险预测

再比如： DNA甲基化推进脑肿瘤的精准分型

还有番茄，玉米的研究，大家自行检索深入学习哦。

当然，更值得一读的是2018年5月， Nature Reviews Molecular Cell Biology 发表的中国科学院上海植物逆境生物学研究中心 朱健康 研究员、 张惠明 研究员与 郎曌博 研究员共同完成的题为“Dynamics and function of DNA methylation in plants”的综述文章。 系统的讨论了植物中DNA甲基化过程。

人体内，DNA甲基转移酶主要有四种：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。

因为药物研发也不是我的领域，这里略~~~

随着高通量生物技术（芯片、测序技术）的不断更新发展，高通量的DNA甲基化数据不断涌现，一些大型国际合作的生物大数据计划产生了Pb（petabyte）数量级的甲基化谱。由多个国家和地区的研究机构组成的“国际人类表观基因组同盟”（International Human Epigenome Consortium，简称IHEC）为了研究与人类健康和包括癌症在内的复杂疾病相关的细胞状态产出了超过1000个表观基因组的数据

摘自：

易基因｜全基因组DNA甲基化测序分析全流程

优质回答全基因组DNA甲基化实验怎么做？从技术原理、建库测序流程、信息分析流程和研究套路等四方面详细介绍。

表观修饰不需要改变 DNA 序列便能实现对性状的改变，表观修饰的改变与基因功能乃至细胞状态、发育、衰老、疾病等存在重要的关联。在众多的表观遗传修饰中，最为重要且研究最为广泛的修饰之一是 DNA 甲基化，而全基因组甲基化测序（WGBS-seq）无疑是最有效的研究手段。

全基因组甲基化测序利用重亚硫酸盐能够将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶 （T）的特性，将基因组用重亚硫酸盐处理后测序，即可根据单个 C 位点上未转化为 C 未转化为 T 的 reads 数目与所有覆盖的 reads 数目的比例，计算得到甲基化率。该技术对于全面研究胚胎发育、衰老机制、疾病发生发展的表观遗传机制，以及筛选疾病相关的表观遗传学标记位点具有重要的应用价值。

全基因组甲基化测序原理示意图入下：

样品检测——样品打断 ——文库构建——BS处理——文库质检

（一）样品检测

对DNA样品的检测主要包括2种方法：

（1）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染，检测具有明显的主带，且条带清晰；

Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量，DNA检测总量不低于1ug。

（二）文库构建

样本检测合格后，使用Bioruptor系统将1µg样品基因组DNA与未甲基化的lambda DNA混合，然后将其片段化，平均大小约为250bp。片段化后，纯化的随机片段化DNA随后用T4 DNA聚合酶，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物进行修复，钝化和磷酸化末端。随后使用Klenow片段（3'-5'exo-）对钝的DNA片段进行3'腺苷酸化，然后与连接5'-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA连接酶的胞嘧啶连接的衔接子进行连接。完成每个步骤后，使用磁珠纯化DNA。之后，根据说明使用ZYMO EZ DNA甲基化金试剂盒将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。最后，用JumpStart Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，再使用磁珠对PCR产物进行纯化获得最终文库。

（三）文库质检

文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度> 2nM），以保证文库质量。

（四）上机测序

文库检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。

（一）原始下机数据质控

原始下机数据为FASTQ格式，是高通量测序的标准格式。FASTQ文件每四行为一个单位，包含一条测序序列（read）的信息。该单位第一行为read的ID，一般以@符号开头；第二行为测序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一个+号，或者与第一行的信息相同；第四行是碱基质量值，是对第二行序列的碱基的准确性的描述，一个碱基会对应一个碱基质量值，所以这一行和第二行的长度相同。以下为一条read信息的示例：

原始下机数据包含建库时引进的接头序列以及质量过低的碱基，这些因素会导致后续比对到基因组的reads较少，从而导致得到的信息较少，因此需要进行过滤。利用trim_galore软件对原始数据进行去除接头序列及低质量碱基等质控步骤。

（二）序列比对

经过质控的reads需要根据与参考基因组的序列相似度比对到参考基因组上。相比于常规基因组及转录组测序，WGBS测序方法产生的数据的特点决定其在比对时存在三大困难：

（1）DNA片段正链和负链经过重亚硫酸盐转化后将不再反向互补，再经过PCR，便会产生四条不同的序列，这将大大增加比对时的计算量。

（2）经过重亚硫酸盐转化后，DNA序列大部分C碱基被转化成T碱基，因此序列含大量T而缺乏C；经过PCR后，产生的互补链则含有大量A而缺乏G。这样便导致序列的复杂度降低（即序列的组成特征更单一），从而增加比对的难度。

（3）C和T的比对是不对称的。经过重亚硫酸盐转化后，序列中非甲基化的C碱基（占大部分）被转化为T，这将导致测序序列与参考基因组不匹配，T既可能应该比对到T上，有可能应该比对到C上；而C则只能比对到C上。这也增加了比对的难度。

利用BSMAP软件进行比对。BSMAP进行比对时，先以参考基因组上C碱基的位置作为指导，将reads中对应参考基因组C碱基位置的T标记为C，其他T保持不变，从而使reads可以直接比对到参考基因组。

（三）甲基化水平计算

甲基化水平可根据未转化为 T 的 C 与转化为 T 的 C 的 reads 的比例计算得到，即：

Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100%

其中，Beta-value 即为该胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 为覆盖该位点的支持甲基化的reads 数目（测得该位点为 C 的 reads），T-reads 为覆盖该位点的不支持甲基化的 reads 数目（测得该位点为 T 的 reads）。 计算原理示意图如下：

利用BSMAP统计甲基化水平。

（四）差异甲基化区域（DMR）鉴定及统计

DMR检测使用权威期刊发表的metilene软件。该软件先将基因组进行预分段，以排除较长序列中不包含CG位点的片段。随后，利用二元分隔算法，递归缩小检测范围，以搜索得到组间累积平均甲基化差异最大的区域，作为可能的DMR；最后，结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），得到准确的DMR。检测原理如下图所示：

本分析检测DMR的标准如下：

（1）区域平均甲基化差异不小于0.1；

（2）CpG位点数不少于5个；

（3）区域长度不小于50 bp；

（4）甲基化水平差异统计检验的校正P值小于0.05；

（5）2D KS-test检验P值小于0.05。

（五）信息分析流程示意图

DNA甲基化组学研究的核心内容在于对DNA甲基化数据的挖掘。DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。

首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。

其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。

最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究

1、背景

小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。

2、方法

利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究

3、结论

全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。

就是关于全基因组甲基化测序实验流程和分析思路的介绍。

参考文献：

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[3] Frank Jühling et al. metilene: Fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data. Genome Research, 2016, 26: 256-262.

[4] Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research, 2000,28(1): 27-30.

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[7] Yuanxin Xi et al. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program. BMC Bioinformatics, 2009, 10:232.

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